1、影响发光的因素主要有：1.含HRP的抗体；2.发光试剂；3.和发光试剂反应的杂质，如含杂质的膜。这里面，在很短时间内曝光造成的背景多是由于含HRP的抗体的因素造成的，抗体浓度过高，洗涤不充分，封闭不充分等都可以造成抗体在膜上的非特异结合，制造背景；转移膜包括最后曝光时包裹的塑料薄膜，含有杂质也会制造背景，这种背景较容易发现鉴别。
2、值得注意的是，发光试剂不好，也会制造背景，这在较长时间曝光的情况下明显，有人做过实验，在较长曝光（30分钟以上），优质的发光试剂背景明显较一般的发光试剂背景低，得到的图像也更漂亮，结果也更可靠。
3、对一些实验来说，如果实验结果本应是多条带，只是一些带由于蛋白量多较强，短时曝光即可检测，而另一些带由于蛋白量相对较少，需要长时间曝光才可检测，这时候主要的影响因素就是发光试剂，因为如果加大抗体的量，普通的发光试剂背景也会相应加大，影响较弱条带的检测，如果减少抗体的量，普通的发光试剂较弱条带不易检测，长时间曝光同样隐藏在背景之中。这时如果不知道还有较弱条带的存在，实验的结论实际上被发光试剂影响了。如果有能长时间曝光而低背景的发光试剂，那么得到的结果就会非常可靠。
